Zielsetzung und Grundlagen der Empfehlungen
Um das Bouillon-Mikrodilutionsverfahren bestimmungsgemäß einsetzen zu können, sind kommerziell verfügbare Mikrotiterplatten, deren Kosten im Rahmen der Routinediagnostik tragbar sind, eine wichtige Voraussetzung. Um die für eine Kostensenkung notwendigen Stückzahlen zu erreichen, aber auch um eine harmonisierte Empfindlichkeitsprüfung in veterinärmedizinischen Laboratorien zu ermöglichen, wurden vom Arbeitskreis Antibiotikaresistenz Empfehlungen für die Beschickung der Mikrotiterplatten mit praxisrelevanten Wirkstoffen und Konzentrationsstufen (sogenannte „Layouts“) erarbeitet.

Die Empfehlungen umfassen für die Veterinärmedizin zugelassene Einzelwirkstoffe und fixe Wirkstoffkombinationen und orientieren sich bei der Auswahl der Wirkstoffe an bekannten, häufig beobachteten Kreuzresistenzen (Werckenthin et al., 2005).
Die Auswahl der jeweiligen Konzentrationsstufen für die gewählten Wirkstoffe erfolgt anhand derzeit verfügbarer klinischer Grenzwerte sowie anhand der verfügbaren Qualitätskontrollbereiche („QC-Bereiche“). Diese werden vom Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) für den tiermedizinischen Bereich in den CLSI-VET-Dokumenten veröffentlicht (CLSI, 2018, 2020). In diesen Dokumenten sind für bestimmte Erreger bzw. Erregergruppen tierart- und organspezifische klinische Grenzwerte aufgeführt. In wenigen Ausnahmen – hauptsächlich im Fall von Wirkstoffen, die zur Bekämpfung von Mastitiserregern beim Rind zum Einsatz kommen – kann es notwendig sein, Grenzwertvorschläge aus entsprechenden Publikationen (Pillar et al. 2009, Feßler et al., 2012, 2017) heranzuziehen.

Vom Arbeitskreis Antibiotikaresistenz wurden vor einigen Jahren auf dieser Basis Empfehlungen für die Testung von (i) Isolaten von Nutztieren („Großtierplatte“, Luhofer et al., 2004), (ii) Isolaten aus Mastitiden des Rindes („Mastitisplatte“, Testung von zwei Erregern je Platte, Luhofer et al., 2004) sowie (iii) Isolaten von Hunden und Katzen („Kleintierplatte“, Werckenthin et al., 2008) erarbeitet. Aufgrund fehlender klinischer Grenzwerte konnte ein Mikrotiterplatten-Layout für Geflügelisolate bisher nicht realisiert werden. Diese Layouts, die mit dem Ziel des Einsatzes in der veterinärmedizinischen Routinediagnostik erarbeitet wurden, wurden zum Teil von den Herstellerfirmen von Mikrotiterplatten in ihr Standardprogramm aufgenommen.

Aktualisierung der empfohlenen Layouts
Aufgrund der Verfügbarkeit einiger neuer Wirkstoffe sowie der Ergänzung von veterinärspezifischen Grenzwerten und QC-Bereichen in den aktuellen Versionen der CLSI-VET-Dokumente wurden Überarbeitungen und Aktualisierungen aller drei Layouts notwendig. Aktualisierten Layouts der Kleintierplatte, der Großtierplatte und der Mastitisplatte wurden in der Aprilausgabe 2017 des Deutschen Tierärzteblattes veröffentlicht.
Bei der Überarbeitung des Großtier-Layouts haben sich im Vergleich zu der publizierten Version (Luhofer et al., 2004) folgende Änderungen ergeben: Die Konzentrationsstufen für die Wirkstoffe Amoxicillin/Clavulansäure, Ampicillin, Ceftiofur, Cephalothin, Enrofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Spectinomycin, Tetracyclin, Tiamulin und Tilmicosin wurden in Hinblick auf aktuell vorhandene QC-Bereiche und Grenzwerte angepasst. Der Wirkstoff Tulathromycin wurde ins Testpanel aufgenommen. Im Gegenzug wurde auf die Testung des Aminocyclitols Apramycin verzichtet. Zum Wirkstoff Colistin ist anzumerken, dass dieser Wirkstoff aufgrund seiner praktischen Relevanz auf der Platte belassen wurde, obwohl nach derzeitigem Stand Testergebnisse nicht mittels CLSI-anerkannter QC-Bereiche und Grenzwerte beurteilt werden können. Für eine Einschätzung des ermittelten MHK-Wertes kann, wenn notwendig, wie bisher auf alte Beurteilungskriterien (siehe Luhofer et al., 2004) zurückgegriffen werden.

Die Überarbeitung des Mastitislayouts führte zu folgenden Änderungen: es wurde die Kombination Kanamycin/Cephalexin neu in das Layout aufgenommen und Marbofloxacin wird stellvertretend für Fluorchinolone getestet.
Auf die Testung von Penicillin G wurde verzichtet, da der Ampicillin-MHK-Wert Aussagen über die Empfindlichkeit grampositiver Bakterien gegenüber Penicillin G zulässt. Da Ampicillin auch gegen gramnegative Bakterien wirksam ist, ermöglicht das somit eine Beurteilung für Penicilline. Wenn Staphylokokken und Streptokokken als Ampicillin-sensibel beurteilt werden, sollte Penicillin G zur Therapie verwendet werden.

Auch bei der Überarbeitung des Kleintier-Layouts haben sich im Vergleich zur publizierten Version (Werckenthin et al., 2008) Änderungen ergeben. Diese umfassen Änderungen der Konzentrationsstufen für die Wirkstoffe Amoxicillin-Clavulansäure (2:1), Ampicillin, Chloramphenicol, Clindamycin, Enrofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Oxacillin, Penicillin G, Tetracyclin und Trimethoprim/Sulfamethoxazol. Die Stufen wurden in Hinblick auf aktuell vorhandene QC-Bereiche und Grenzwerte angepasst. Für die Fluorchinolone wurde der Wirkstoff Pradofloxacin zusätzlich zu Enrofloxacin in das Testpanel aufgenommen. Die beiden Wirkstoffe Difloxacin und Orbifloxacin wurden aus Platzgründen aus dem Panel genommen, da derzeit jeweils nur ein einziges Präparat in Deutschland zugelassen ist und entsprechende Beurteilungen der Empfindlichkeit/Resistenz dieser beiden Wirkstoffe aus den MHK-Werten gegenüber Enrofloxacin extrapoliert werden können. Zusätzlich wurde der Wirkstoff Cefalexin in das Layout aufgenommen und ersetzt nun den Wirkstoff Cephalothin. Für die Beurteilung des Drittgenerations-Cephalosporins Cefovecin muss beachtet werden, dass bisher keine CLSI-anerkannten Grenzwerte zur Verfügung stehen, weshalb derzeit noch auf die entsprechenden Herstellerangaben zurückgegriffen werden muss.

2021/2022 wurden die Layouts der Kleintier- und Großtierplatte nochmals überarbeitet um den aktuellen Gegebenheiten bzgl. der Verfügbarkeit von QC-Bereichen und klinischen Grenzwerten Rechnung zu tragen (Stand 2022).

Beim Kleintier-Layout wurden die Testbereiche von Amoxicillin/Clavulansäure, Ampicillin, Penicillin, Cefalexin, Cefovecin, Clindamycin, Pradofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Tetracyclin und Trimethoprim/Sulfamethoxazol angepasst (und meist Teststufen im unteren Bereich gestrichen). Bei Erythromycin werden nun lediglich zwei Konzentrationen getestet, um eine induzierbare Makrolidresistenz bei Staphylokokken und Streptokokken nachweisen zu können. Die eingesparten Wells wurden zur Erweiterung des Testbereichs für Trimethoprim/Sulfamethoxazol und die Aufnahme der Substanzen Florfenicol (1 – 8 mg/L) und Doxycyclin (0.06 – 1 mg/L) verwendet.

Für das Großtier-Layout ergaben sich folgende Änderungen: Die Testbereiche für Amoxicillin/Clavulansäure, Ampicillin, Penicillin, Erythromycin (s. Kleintier-Layout), Gentamicin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol, Tiamulin, Tetracyclin und Tulathromycin wurden angepasst. Auf die Testung von Cephalothin und Spectinomycin wurde verzichtet, da es in Deutschland derzeit keine zugelassenen Präparate mit Cephalothin und nur Kombinationspräparate von Spectinomycin mit Lincomycin gibt und die Testung der Einzelsubstanz hier keinen Mehrwert bringen würde. Neu auf die Platte aufgenommen wurden dafür die Wirkstoffe Gamithromycin (0,25 – 8 mg/L) und Tildipirosin (1 – 32 mg/L), für die auch Grenzwerte verfügbar sind.

 
Literatur:
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2018. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals; approved standard - fourth edition. CLSI document VET01 5^th ed.. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA.

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2020. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals; third informational supplement. CLSI document VET01S 5^th ed.. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA.

Feßler AT, Kaspar H, Lindeman CJ, Stegemann MR, Peters T, Mankertz J, Watts JL, Schwarz S (2012). A proposal of interpretive criteria for cefoperazone applicable to bovine mastitis pathogens. Vet. Microbiol. 157, 226-231.

Feßler AT, Kaspar H, Lindeman CJ, Peters T, Watts JL, Schwarz S (2017). Proposal for agar disk diffusion interpretive criteria for susceptibility testing of bovine mastitis pathogens using cefoperazone 30 µg disks. Vet Microbiol. 200; 65-70.

Luhofer G, Böttner A, Hafez HM, Kaske M, Kehrenberg C, Kietzmann M, Klarmann D, Klein G, Krabisch P, Kühn T, Richter A, Sigge C, Traeder W, Waldmann K-H, Wallmann J, Werckenthin C, Schwarz S (2004). Vorschläge der Arbeitsgruppe „Antibiotikaresistenz“ für die Belegung von Mikrotiterplatten zur Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen in der Routinediagnostik – Mastitis- und Großtierlayouts. Berliner Münchner Tierärztliche Wochenschrift 117, 245-251.

Pillar CM, Goby L, Draghi D, Grover P, Thornsberry C (2009). Evaluating the in vitro susceptibility of bovine mastitis pathogens to a combination of kanamycin and cefalexin: Recommendations for a disk diffusion test. J Dairy Sci. 92, 6217-6227.

Werckenthin C, Böttner A, Hafez HM, Hartmann K, Kaske M, Kehrenberg C, Kietzmann M, Klarmann D, Klein G, Krabisch P, Kühn T, Luhofer G, Richter A, Schulz B, Schwarz S, Sigge C, Traeder W, Waldmann KH, Wallmann J (2005). Kreuzresistenzen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen in der Veterinärmedizin: Molekulare Grundlagen und praktische Bedeutung für die Empfindlichkeitsbestimmung. Berliner Münchner Tierärztliche Wochenschrift 118, 471-480.

Werckenthin C, Luhofer G, Böttner A, Gangl A, Goossens L, Hafez HM, Hartmann K, Kaske M, Kehrenberg C, Kietzmann M, Klarmann D, Klein G, Krabisch P, Kühn T, Richter A, Schulz B, Schwarz S, Sigge C, Traeder W, Waldmann KH, Wallmann J (2008). Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen in der Routinediagnostik: Vorschlag für ein Layout für Mikrotiterplatten zur Testung von Bakterien von Hunden und Katzen. Berliner Münchner Tierärztliche Wochenschrift 121, 19-26.